今天分享一篇澳洲莫纳什大学生殖健康中心Loveland博士课题组在《Human Reproduction》期刊上发表的WNT signalling in the normal human adult testis and in male germ cell neoplasms，影响因子为5.733分，属于中科院SCI 一区期刊。
doi:10.1093/humrep/deaa150
文章的关键术语
WNT signalling
spermatogenesis 精子发生
testicular germ cell tumor/TGCT睾丸生殖细胞瘤
研究主旨
本研究阐明了WNT信号通路在人睾丸中正常和肿瘤生殖细胞发挥的作用。这项研究采用了几种组织学方法，确立了参与WNT信号通路的蛋白在人睾丸中的表达定位图谱。同时Loveland博士课题组还鉴定出特定阶段和细胞类型是否直接受到WNT配体的影响。另外，该课题组还利用了TCam-2精原细胞瘤细胞系确定抑制信号通路的功能影响，以为筛选出治疗生殖细胞瘤的合适靶点。
WNT信号通路调控着各种生命活动的过程，包括生殖细胞生长发育。在肿瘤发生发展中，WNT信号通路的改变也发挥着一定作用，但目前尚未明确TGCT里WNT通路的成分和功能。
研究思路
该课题组在组织、细胞、分子水平上通过免疫组化、原位杂交、PCR和细胞活力检测都做了验证，而且文章能吸引读者，原创性高，所以最终能发表在5.733分期刊上。
得到病人的知情同意后，收集睾丸癌组织样本以及正常睾丸组织样本，做石蜡包埋切片。利用TCam-2和SW480细胞系进行体外细胞培养。反转录PCR得到CTNNB1和AXIN2的cDNA后，转导入DH5α细菌细胞，用菌落PCR筛选和测序进行验证。之后，制备好的石蜡切片用蛋白酶K处理，接着用cRNA探针做原位杂交。从TCam-2细胞、SW480细胞和受精后12.5天的小鼠胚胎中分离出RNA，接着做Northern blot分析。在正常睾丸组织和睾丸癌组织切片上做免疫组化分析，检测CTNNB1、TCF7L1、TCF7L2。细胞爬片和免疫荧光分析，检测CTNNB1、TCF7L1、TCF7L2在TCam-2细胞的表达定位分布。siRNA实验：接种培养TCam-2细胞后，用RNAiMAX系统做转染，siRNA结合于TCF7L1和TCF7L2并转染到TCam-2细胞中。未处理的TCam-2细胞和阴性对照siRNA作为对照。转染后1、3、5天后收集TCam-2细胞进行RNA分析。再用qRT-PCR做基因敲除鉴定。qRT-PCR实验：从TCam-2细胞中分离RNA，反转录成cDNA，然后上样跑PCR。细胞数量和细胞活力检测细胞迁移实验研究结果在正常人睾丸切片上做原位杂交检测WNT通路的CTNNB1和AXIN2的定位情况，发现典型的WNT通路在生精细胞中较为活跃。
免疫组化法检测睾丸生殖细胞瘤GCNIS切片上的WNT通路的信号分子CTNNB1、WNT3A、TCF-1、TCF7L1、TCF7L2的表达定位分布情况，发现CTNNB1蛋白主要存在于GCNIS的细胞质和支持细胞里，WNT3A则在支持细胞里表达量很少，但主要表达在生精小管周围的间质区域内。TCF-1在GCNIS细胞核内和支持细胞都有表达。TCF7L1和TCF7L2只表达在GCNIS细胞核内。
免疫组化检测精原细胞瘤上WNT通路信号分子的定位分布情况，发现了CTNNB1分布在细胞浆内。WNT3A分布在周围细胞之间，似乎表明了免疫浸润现象的出现。
这图表明了TCam-2细胞能够受WNT的刺激而作出反应，则会快速把CTNNB1在核内积累到一定程度。
以下这图表明了WNT拮抗剂显著影响了TCam-2细胞的生长发育和迁移，TCam-2对WNT拮抗剂主要作用在通路的两个特定位点：IWR-1(破坏复合体的稳定性增加)以及CCT036477(抑制CTNNB1-TCF/LEF之间的相互作用)。
这图显示了抑制WNT信号通路能抑制TCam-2细胞的迁移，但当在5%血清培养时未必影响其细胞数量。
这图表明了抑制TCam-2细胞内TCF7L1和TCF7L2的抑制会导致迁移能力的下降。
终上所述，这项研究提供了新的证据，表明WNT信号通路在正常的精子发生过程中保持活跃的状态，也在生殖细胞瘤内呈现出相关性。抑制生殖细胞瘤内的WNT通路会减弱细胞生存能力和迁移力，这可为日后使用小分子(siRNA)抑制剂作为治疗转移性TGCT提供有力的证据。
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